A gyulladásos gócok az otikus kapszulában bárhol előfordulhatnak, azonban predilekciós helyük a fissula ante fenestram. Az itt növekvő otoszklerotikus gócok az ovális ablak fülkéjét beszűkítve akadályozzák a stapes­tal­pat mozgásában, ezzel útját állva a kívülről érkező hangrezgések továbbítódásának a belső fül felé. Így az otosclerosisban szenvedő betegnél leggyakrabban vezetéses halláscsökkenést állapítunk meg, azonban a tünetek a gócok elhelyezkedésétől függenek. A cochlea endoszteumának érintettsége esetén szenzorineurális halláscsökkenés alakulhat ki, míg a félkörös ívjáratok involvációja során szédüléses panaszok jelenhetnek meg. A betegség kaukázusi populációban 0,3-0,38%-ban, amíg az összes halláscsökkenés között 5-7%-ban, és a vezetéses halláscsökkenéses esetek 18-25%-ában fordul elő. Ebből következik, hogy az otosclerosis becsült éves incidenciája körülbelül 6-8/10 000 lakos. Kórbonctani leletek tanúsága szerint a fehér populáció temporális csontjainak feldolgozása alapján a lakosság 8-11%-ában találhatóak panaszt nem okozó otoszklerotikus fókuszok. A betegségre női dominancia és 30-40 év körüli kezdet jellemző. Hazánkban az elmúlt időszakban 200-250 stapes műtétet végeznek évente, amelyek hátterében nagyjából 150 esetben otosclerosis áll.
 
Az elmúlt évtizedek alatt a csontanyagcsere molekuláris mechanizmusait intenzíven tanulmányozták. A csontanyagcsere szabályozása kettős természetű. A jól ismert endokrin rendszeren kívül egy komplex és kifinomult kölcsönhatásokból álló lokális hálózatot identifikáltak oszteoblasztok, oszteoklasztok és számtalan nem­rég azonosított mediátor között. A csontlebontást (re­szorpció) és az újcsontképződést szigorúan szabályozott egyensúly tartja fenn citokinek és egyéb mediátorok szofisztikált összjátéka által.

Az oszteoklasztok a monocita/makrofág család progenitor sejtjeinek fúziója által alakulnak sokmagvú óriássejtekké, hogy ellássák elsődleges feladatukat, a csontreszorpciót. Az oszteoblasz­tok a csont felépítéséért felelnek, szerepük a csontanyagcsere modulálásában nélkülözhetetlen. Egészséges szervezet esetén a lebontó és felépítő folyamatok szimultán futnak, és fenntartják a fiziológiás egyensúlyt a csontmetabolizmusban.

A RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand) a legtöbb sejten expresszálódik, beleértve az oszteoblasztokat is. Az oszteoklasztokon elhelyezkedő specifikus RANK receptor aktivációján keresztül a RANKL kötődése elősegíti az oszteo­klasz­tok differenciálódását, aktivációját és túlélését. Az osteo­protegerin (OPG) erőteljesen gátolja a csontreszorpciót és jelentősen csillapítja az oszteoklasztogenezist. Az OPG egy oldott állapotban lévő „csali” receptor, amely a RANK-kal verseng a RANKL-ért. Ezáltal, az oszteoklasztokon és prekurzoraikon jelen lévő RANK-ot az OPG kompetitív módon gátolja, ezzel a lebontó sejtek csökkent differenciálódását, túlélését és a prekurzor sejtek redukált fúzióját okozza. Jelentősen emelkedett OPG mRNS-szinteket mutattak ki az otikus kapszula lágyszöveteiben (ligamentum spirale, Corti-féle szerv támasztósejtjei, limbus spiralis interdentális sejtjei). Mindemellett a perilympha is meglehetősen magas koncentrációban tartalmazott OPG-t. Immun­hisz­tokémiai vizsgálat segítségével a csontos otikus kapszulában nem volt detektálható OPG expresszió. Mindebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az OPG feltételezhetőleg a cochlea lágy szöveteiben keletkezik, innen szekretálódik a perilymphába, aminek segítségével az otikus kapszula lacunocanalicularis rendszerét használva folyamatosan diffundál a környező csontba. Az egészséges otikus kapszula elenyésző csontforgalommal bír, és valószínűleg a nagy mennyiségű OPG miatt majdnem teljesen oszteoklasztmentes. Elképzelhető, hogy ez az egyik oka annak, hogy az otikus kapszula mind morfológiájában, mind fejlődésében páratlan az emberi szervezetben.

Az otoszklerotikus fókuszok hisztológiai aktivitását I-től (legaktívabb) IV-ig (teljesen kimerült) osztályozhatjuk függően a cellu­lari­tástól, a vaszkularizáció mértékétől, az extracelluláris kollagén mátrix mennyiségétől és az oszteociták jelenlététől. Egy aktív otoszklerotikus gócban számottevő oszteoklaszt, fibro­blaszt, óriás sejt és proliferáló endothel sejt helyezkedik el, amelyek a megnövekedett metabolikus aktivitásért és a szekunder módon kialakuló szivacsos szerkezetért felelősek. Az otoscle­ro­sis korai stádiumát kanyaróvírus fertőzés és az egyidejűleg fennálló gyulladás jellemzi. Erre a megnövekedett csontreszorpcióra válaszolva regeneratív folyamat indul be a fókuszban, ami oszteoblasztok és fibroblasztok által vezérelt fibrotikus átalakuláshoz vezet. Összegezve, a betegség aktív fázisa detektálható kanyaróvírus részecskékkel, járulékos gyulladással, bőséges tumor necrosis factor a (TNFa) expresszióval és OPG negati­vi­tás­sal jellemezhető. Az inaktív fázist a kanyaró és OPG pozitivitás, a TNFa negativitás és a gyulladás egyöntetű hiánya reprezentálja.

A hiányos kanyaróvírus antigének MHC I molekulák közbenjárásával expresszálódnak a fertőzött oszteoklasztok, oszteoblasz­tok, fibroblasztok és endothel sejtek felszínén. Ennek következtében, CD8+ T-sejt függő immunválasz vezet TNFa felszabaduláshoz és konszekutív csontlebomláshoz. Ez a legéletképesebb teória, bár az aktivált monociták, makrofágok, T- és B-sejtek és oszteoklasztok is képesek az oszteolítikus fókuszba TNFa-t kiválasztani, és így állandó jelleggel továbbra is fenntartani a gyulladásos eseményeket. A TNFa egy pro-inflammatorikus citokin, ami nélkülözhetetlen szerepet játszik a csontvelőből származó mononukleáris sejtek oszteoklaszttá és a stromális sejtek oszteo­blaszttá differenciálódásában. Ez a citokin az oszteoklasz­tok és oszteoblasztok közötti intercelluláris kommunikáció elengedhetetlen parakrin mediátora. Az emelkedett TNFa koncentráció stimulálja az oszteoklaszt aktivációt, facilitálja a RANKL expressziót és csökkenti az oszteoklaszt apoptózist. Így oszteo­lízishez, míg hosszú távon a csont szivacsosodásához vezet. A korai otosclerosisban végbemenő TNFa túltermelődés az OPG szekréció gátlásának és a RANKL termelődés fokozásának kettős hatása által tovább stimulálja az oszteoklaszt képződést. A TNFa ugyanazokat a csatornákat felhasználva, mint az OPG – a perilymphából az otikus kapszulába vándorlása során – bekerülhet a perilymphába és a cortilymphába is. A TNFa gátolja a külső szőrsejtek elektromotilitását, ezzel sensorineurális hallászavart képes kiváltani. Mivel az otosclerotikus góc állítja elő a TNFa-t, így elképzelhető, hogy az otosclerosisban előforduló szenzorineurális halláscsökkenés hátterében is a gazdagon felszabaduló TNFa áll.

Eltekintve a RANKL/OPG rendszertől és a proinflammatorikus citokinektől, otosclerosisban a TNFa és a proteolitikus enzimek is részt vehetnek a csontreszorpcióban. Otoszklerózisban a cathep­sin B és D szerepe régóta feltételezett. A korai gyulladást és a csontreszorpciót megnövekedett csontképződés és szkle­ro­tizáció követi. Manapság a szárnynélküli fehérje, a Wnt-b-cateninrendszer felelőssége merül fel az oszteoblaszt aktiváció és a csontfelépülés folyamatában. A Sclerostin és a Dickkopf-1 (DKK-1) fehérje a Wnt, és ezáltal a csontképződés gátlószerei is. Így a RANKL/OPG redszeren kívül a Wnt/DKK-1 sclerostin egyensúly is befolyásolja a csontremodelling jelenségét. Érdekes azonban, hogy a TNFa nemcsak elősegíti a csontfogyást a RANKL indukciója által, hanem képes stimulálni a DKK-1-et és indirekt módon blokkolni a Wnt-mediált csontfelépülést. Sajnálatos, hogy csak nagyon kevés információ érhető el a Wnt-b-catenin/sclerostin-DKK-1 rendszer lehetséges szerepéről oto­sclerosis esetén, azonban a Wnt-t és a cél-génjét sikerült azonosítani a belső és a középfül különböző részein.

Egy ugyancsak nélkülözhetetlen citokin, a transforming growth factor b (TGFb) is bonyolítja az otosclerosis patogenezisét. A TGFb1 a legnagyobb mennyiségben megtalálható növekedési faktor az emberi csontban. Kritikus szerepet játszik a mezen­chymális sejtek oszteoblaszttá történő érésének előmozdításában. Továbbá befolyásolja a mátrixképződést, a szöveti fibrózist és a mineralizációt is. A TGFa köcsönhatásba kerül a legtöbb jól ismert jelátviteli útvonallal az oszteoblasztok működése kapcsán, többek között a Wnt-b-catenin rendszerrel is. Korábban már említésre került, hogy az otosclerosisban létrejövő csontre­szorp­ciót követő fibrózis és csontújdonképződés javító mechanizmusnak tekinthető. Ezen folyamatokban szerepet játszó, TGFb géncsaládba tartozó bone morphogenetic proteinek (BMP) is tovább bonyolítják az otosclerosis patogenezisét.

Jelenleg, az otosclerosis legfontosabb kezelése még mindig sebészi (stapedectomia és stapedotomia) természetű, ami teoretikusan képes megszüntetni a halláscsökkenés vezetéses komponensét, azonban abszolút tehetetlen a progresszív szenzorineurális hallásvesztéssel szemben. Ezért szükséges megérteni az oto­sclerosis patogenezisét és molekuláris mechanizmusait, hogy képesek legyünk olyan farmakológiai vegyületek kifejlesztésére, amelyek segítségével be tudunk avatkozni a fent leírt molekuláris vagy sejtes mechanizmusokba.

Célkitűzések

• Otoszklerotikus stapestalpakból immunfluoreszcens vizsgálattal a COL1A1 és COL1A2 által kódolt I-es típusú kollagén a-1 és a-2 láncok expressziós szintjének és mintázatának feltérképezése.
• Ankylotikus stapestalpakból RT-PCR-vizsgálat segítségével COL1A1 és COL1A2 allél-specifikus mRNS kimutatás. Patológiás transzkripciós variánsok esetén azok meghatározása.
• Otoszklerotikus gócot tartalmazó stapestalpakban BMP 2-, 4-, 5- és 7-specifikus immunfluoreszcens próbával a fehérje expresszió kimutatása. Az eredmények összevetése az otosclerosis szövettani stádiumával és klinikai aktivitásával.
•  Otoszclerotikus stapestalpakból és cadaver humán veseszövetből renin-angiotenzin-aldoszteron-specifikus (RAAS) im­mun­fluoreszcens analízis végzése. A kapott fehérje ex­presszi­ós szintek és az eloszlási viszonyok értelmezése.
• Az első olyan genetikai asszociációs vizsgálat létrehozása, amely szövettanilag igazolt otoszklerózisos és nem otoszkle­rózisos betegek teljes DNS állományára épül, és a korábban leírt génspecifikus SNP-k szerepét tanulmányozza.

Anyagok és módszerek

Jelen tudományos összefoglaló munka négy kísérletsorozatot mutat be, így a módszertant is ennek megfelelően, szeparálva tárgyaljuk.

I-es típusú kollagén A1 és A2 alléljeinek vizsgálata

Klinikailag stapes fixációban szenvedő betegekből stapedectomia során 55 ankylotikus stapest (n=55, nő=34, férfi=21) távolítottunk el és laterális atticotomia során 30 különböző kortikális csontfragmentumot gyűjtöttünk. A mintákat egyenlőtlenül két részre osztottuk, a nagyobbik hányadból (40 stapes és 20 kontroll) szövettani vizsgálatot végeztünk hagyományos hematoxilin-eozin és COL1A1/A2-specifikus immunfluoreszcens festéssel. A kisebbik részből (15 stapes és 10 kontroll) COL1A1/A2-specifikus RT-PCR-t végeztünk.

BMP2-, 4-, 5- és 7-specifikus immunfluoreszcens vizsgálat

67 klinikailag stapes ankylosisban szenvedő beteg (n=67, férfi=26, nő=41) teljes stapeséhez jutottunk ugyancsak stapedec­tomia kapcsán. Csontspecifikus kontrollként 35 kortikális csont­fragmentumot gyűjtöttünk be laterális atticotomia hozományaképpen. A mintákon szövettani vizsgálatot végeztünk, minden mintát hagyományos hematoxilin-eozin festéssel és BMP2-, 4-, 5- és 7-specifikus immunfluoreszcens próbával analizáltunk.

RAAS-specifikus immunfluoreszcens analízis

Stapedectomia során 20 ankylotikus stapest (n=20, nő=16, 4=férfi) távolítottunk el klinikailag stapes fixációban szenvedő betegből és 10 humán cadaver vese-szövetmintához jutottunk. Emellett 10 különböző kortikális csontfragmentumot gyűjtöttünk stapes ankylosisos betegek külső hallójáratából. A mintákon szövettani vizsgálatot végeztünk, minden mintát egyenként hematoxilin-eozin festéssel és RAAS-specifikus (renin angioten­zin konvertáló enzim, angiotenzin II, angiotenzin II receptor) immun­fluoreszcens próbával vizsgálatunk.

Genetikai asszociáción alapuló tanulmány

153 szövettanilag igazolt otoszklerotikus stapest (n=153, férfi=65, nő=88) távolítottunk el stapedectomia során. Minden betegtől posztoperatív módon vérmintát gyűjtöttünk be. 300 halláscsökkenésben nem szenvedő és otoszkópos vizsgálat során betegségmentes önkéntestől ugyancsak vérmintát szereztünk. Az otosclerosis diagnózisát hagyományos hematoxilin-eozin festés alapján mondtuk ki. A korábban irodalmi adatok alapján az otosclerosisra hajlamosító gének (COL1A1, TGFa1, BMP2, BMP4, AGT, RELN) SNP-it vizsgáltuk genotipizálással és asszociációs teszteléssel.

Eredmények

Eredményeinket az „Anyagok és módszerek” fejezetben megkezdett felosztás alapján tárgyaljuk.

I-es típusú kollagén A1 és A2 alléljeinek vizsgálata

Immunfluoreszcens vizsgálataink alapján az otoszklerotikus és a nem-otoszklerotikus stapestalpakban normális mennyiségű és egyenletes eloszlású COL1A1 és COL1A2 expressziót detektáltunk és megállapítottuk, hogy az immunreakció intenzitása teljesen függetlennek bizonyult a stapes fixáció szövettani diagnózisától. A szuperstruktúrák, a talpak és a vesztibuláris felszínek hyalinporc rétegei rendkívül hasonló expressziós mintázatot mutattak. A stapes fixáció negatív kontrolljaként használt kortikális csontok átlagos I-es típusú kollagén expressziót reprezentáltak. A COL1A1/A2 allélek expressziós mintázata nem mutatott szignifikáns korrelációt az otosclerosis szövettani diagnózisával.

Az ankylotikus stapestalpakból és az összes negatív kontrollból sikerült humán sejtes RNS-t kimutatni, alátámasztva ezzel azt, hogy az mRNS extrakciós folyamatunk optimálisan működött. Az A1 és A2 allélspecifikus mRNS kimutatása RT-PCR-rel minden stapestalp mintából sikerült. A negatív kontrollként használt kortikális és hallócsontok is szabályos COL1A1/A2 allél expressziót mutattak RT-PCR-rel. Patológiás transzkripciós variánst nem detektáltunk.

BMP2-, 4-, 5- és 7-specifikus immunfluoreszcens vizsgálat

Az aktív otoszklerózisos esetek szimultán emelkedett BMP2, 4, 5 és 7 expressziót mutattak, amelyek intenzív granuláris immunreakcióban nyilvánultak meg. Az oszteoklasztok és az oszteo­blasztok a különböző típusú BMP-kre tekintélyes pozitivitással reagáltak, ezzel jelezve a lézión belüli aktív csontre­mo­dellációt és a csontújdonképződést. A BMP immunreaktivitás váltakozott a stapes minták különböző részeiben. A szuperstruktúra negatív volt BMP-re, míg a léziót tartalmazó talp és a vestibuláris felszín hyalinporc rétege nagyon hasonló expressziós mintázatot jelzett. Ezzel szemben, inaktív otoszklerotikus fókuszokban a sejtes maradványok felszínén nem volt szignifikáns BMP expresszió kimutatható. A nem otoszklerotikus stapes fixációk nem ábrázoltak immunreakciót BMP-re. A negatív kontrollként használt kortiká­lis csontok és incus minták szintén negatív BMP-specifikus immunreakciót adtak. Végezetül, a különböző típusú BMP-k ex­pressziója szoros kapcsolatban állt az otosclerosis szövettani diagnózisával és annak aktivitásával.

RAAS-specifikus immunfluoreszcens analízis

Az aktív vagy inaktív otoszklerotikus gócot ábrázoló stapestalpak negatív immunreakcióval jellemezhetőek reninre, angiotenzin II-re, angiotenzin konvertáló enzimre és angiotenzin II receptorra nézve. A hiányzó fehérje expresszió függetlennek bizonyult a szövettani diagnózistól és az otosclerosis szövettani aktivitásától is.

Korábbi megfigyelésekkel egyetemben, pozitív kontrollként humán veseszövet-mintákat alkalmaztunk erőteljes citoplazmatikus RAAS expressziójuk miatt. A glomerulusok epitél sejtjei, a proximális és disztális kanalikulusok és a juxtaglomeruláris apparátus módosult neuroendokrin sejtjei is meglehetősen intenzív immunreakcióban pompáztak.

A csontspecifikus kontrollként használt kortikális csontfrag­men­tu­mok jelentős mennyiségű RAAS-specifikus immunreakciót adtak. A perivaszkuláris régióban csontvelői progenitor sejtek gyenge gyűrűszerű és helyenként homogén immunreaktivitást produkáltak a RAAS négy tanulmányozott tagja ellen.

Genetikai asszociáción alapuló tanulmány

Korábbi tanulmányok eredményei alapján leírt 13 otosclerosis-specifikus SNP-t genotípizáltunk. Az aktív és inaktív otoscle­ro­sis­ban szenvedő betegek értékeit hasonlítottuk a kontrollokban kiszámolt asszociációs szintekhez. Az aktív és az inaktív oto­szkle­rózisos csoportot egyben (nem szeparálva) vizsgáltuk, hogy elkerüljük a metaanalízis szignifikancia erejének drasztikus csökkenését. A minták szignifikáns SNP asszociációt kimutató, becsült statisztikai ereje (statistical power) 16% és 80,5% között mozgott. A korábban kiszámított Hardy-Weinberg equilibrium értékeitől egyetlen SNP sem mutatott deviációt. A logisztikus regressziós vizsgálattal végzett asszociációs számítás egy SNP (rs1800472, TGFB1) esetén mutatott statisztikailag szignifikáns összefüggést az otosclerosissal.

Új megfigyelések

 
Otoszklerotikus szövettanilag igazolt stapestalpakban nem jelenik meg a kontrolltól eltérő I-es típusú kollagén b-1 és b-2 lánc expresszió, emellett ugyancsak nem található RT-PCR-rel patológiás COL1A1 és COL1A2 variáns. Véleményünk szerint az I-es típusú kollagén nem felelős az otosclerosis kialakulásáért.

Ugyancsak otoszklerotikus szövettanilag megerősített stapestal­pakból az irodalmi adatokkal megegyezően sikerült detektálnunk immunfluoreszcens vizsgálattal BMP2, 4 és 7-et, ezen felül elsőként számolunk be a BMP5 fokozott expressziójáról otoszkle­ró­zisos stapestaplakban. Elképzelésünk szerint a BMP-k a lítikus folyamat utáni regenerációban játszanak nélkülözhetetlen szerepet.
 
A korábbi felvetésekkel ellentétben, szövettanilag igazolt oto­szkle­rotikus stapestalpakban nem jelenik meg kimutatható RAAS expresszió, így feltételezésünk szerint a RAAS nem tehető felelőssé az otoszklerózis kifejlődéséért.
Nemzetközi összefogásban, elsőként párosítottunk asszociációs tanulmányhoz szövettanilag megerősített stapestalpakat, amelyek alapján a vizsgálat SNP-kből úgy tűnik, hogy a TGFb1 mutációja szerepet játszik az otoszklerózis etiopatogenesisében.

Megbeszélés

 
Az otoszklerózis etiológiájának modelljét jelenleg úgy képzeljük, hogy perzisztáló kanyaróvírus fertőzés hatására az otikus kapszulában lévő oszteoblasztok, oszteoklasztok, fibroblasztok és endothel sejtek saját felszínükön MHC I molekulák segítségével töredezett kanyaróvírus antigéneket expresszálnak. Ez a folyamat CD8+ T-sejt függő immunválaszt vált ki, amelynek hatására nagy mennyiségű TNFa szabadul fel és következményes csontlebomlás indul meg. Ezzel egyidőben az otikus kapszula emb­rion­ális kondroblasztjai és oszteoblasztjai, valamint az ideván­dorolt oszteoklasztok reaktivációs folyamaton mennek keresztül, ugyancsak a kanyaróvírus-fertőzés következtében. Az oto­szklerotikus gócok oszteoklasztjai és oszteoblasztjai CD51/61 (oszteoklaszt funkcionális antigén) molekulát expresszálnak, ráadásul megnövekedett BMP, TGFb és TNFa expresszió mutatható ki. Az aktivált monociták, makrofágok, T- és B-sejtek és az oszteoklasztok is képesek az oszteolitikus fókuszba TNFa-t szekretálni, és ezzel továbbra is fenntartani a gyulladásos eseményeket.

Jelen kísérletsorozatunkkal bizonyítottuk, hogy a TGFa1 rs1800472 SNP-je (T263I) szerepet játszik az otoszklerózis patogenezisében. Emellett a BMP2, 4, 5 és 7 magas szöveti expressziója szintén nem elhanyagolható, azonban véleményünk szerint ezen molekulák pusztán az oszteolitikus gyulladás helyreállító mechanizmusában vesznek részt. Továbbá, kísérletes munkánk eredményeképpen úgy gondoljuk, hogy a COL1A1, COL1A2 és a RAAS a korábbi irodalmi felvetésekkel szemben, nem játszik szerepet az otoszklerózis patogenezisében.

Köszönetnyilvánítás

Hálás köszönettel tartozom témavezetőmnek dr. med. habil. Karosi Tamás PhD. Főorvos Úrnak, hogy lehetőséget adott számomra kutatócsoportjában. Időt és fáradtságot nem kímélve vezetett be a tudományos világba és mindvégig precízen irányította kutatásaimat. Igényes szemléletével segített eligazodni az experimentális tudományok területén és megtanított gondolataim interpretálására nemzetközi folyóiratokban.
Köszönöm édesapámnak, dr. Liktor Bálint Főorvos Úrnak, hogy fül-orr-gégészeti pályámon elindított, következetességével és rendkívüli szakmai felkészültségével igazi „alma mater”-t teremtett, amelyben én is részt vehettem. Nemcsak a fülsebészet alapjait sajátíthattam el tőle, hanem bevezetett a stapes sebészet kivételes világába is.
Ugyancsak köszönettel tartozom munkatársamnak, dr. Csomor Péternek, aki áldozatos módon segített eligazodni a laborban és megtanított a szövettani metszetek elkészítésére.
Végül, de nem utolsó sorban szeretném köszönetemet kifejezni családom tagjainak, irányomba tanúsított türelmükért és segítőkészségükért.
Tanulmányaink az OTKA PD75371, K81480, DEOEC Mec 17/2008, TÁMOP4.2.1B pályázatok financiális segítségével készülhetett el.